2025年3月17日,上海科技大學王皞鵬、中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心許琛琦、美國匹茲堡大學醫(yī)學院Dario Vignali、北京大學腫瘤醫(yī)院孔燕及百濟神州沈志榮團隊合作,在《Cell》雜志上發(fā)表了題為“Ligand-induced ubiquitination unleashes LAG3 immune checkpoint function by hindering membrane sequestration of signaling motifs”的研究文章。該研究首次闡明了免疫檢查點LAG3受體激活的分子開關機制,并開發(fā)了基于功能性生物標志物的療效預測體系,為靶向免疫檢查點的精準治療提供了新策略。

?免疫檢查點是T細胞表面的抑制性受體,腫瘤可通過激活這些受體來抑制T細胞功能,從而實現免疫逃逸。免疫檢查點抑制劑可解除這種抑制作用,激活機體的抗腫瘤免疫響應,相關研究曾獲2018年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。繼PD-1和CTLA-4之后,LAG3靶向藥物于2023年獲得美國FDA批準上市,成為第三個獲批的免疫檢查點藥物,標志著腫瘤免疫治療的又一次重要進展。與其他免疫檢查點療法類似,LAG3免疫療法的臨床響應率仍然不高,僅有部分患者從中獲益。如何精準篩選可能獲益的患者群體成為當前急需突破的臨床瓶頸。破解這一難題需要對LAG3的作用機制有深入的認識。然而,自1990年LAG3被發(fā)現以來,其配體結合如何觸發(fā)LAG3受體活化的分子機制一直不清楚,成為困擾該領域多年的關鍵科學問題。
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為探究LAG3受體的激活機制,研究團隊利用國家蛋白質科學研究(上海)設施質譜系統(tǒng)對LAG3蛋白的翻譯后修飾(PTM)進行了系統(tǒng)分析,通過bottom-up的手段對樣品進行了膠內酶解和質譜數據的采集分析等工作,發(fā)現LAG3受體結合配體后,其K498位點發(fā)生快速多泛素化修飾。這種泛素化修飾不會介導LAG3的降解,反而對LAG3的功能具有關鍵調控作用。

圖1.?配體結合觸發(fā)LAG3 K498位點泛素化修飾
LAG3近膜區(qū)富含堿性殘基信號基序(Basic residue Rich Sequence,又稱BRS基序),緊隨其后的是關鍵信號域FSALE以及泛素化位點(圖2A)。為了探究LAG3免疫抑制功能的分子機制,研究人員依托蛋白質設施核磁系統(tǒng)Bruker 900 MHz和Bruker 600 MHz儀器,檢測了LAG3胞內區(qū)與膜脂的相互作用。為進行互作檢測,研究人員合成了包含FSALE和BRS的LAG3 N端胞內區(qū)(LAG3-NCR ,R475-K498)以及胞內區(qū)全長(LAG3-FL)的兩種多肽;質膜雙層類膜體系選用了bicelle體系,組分分別為模擬生理脂質組成的PMLC(plasma membrane-like composition;30% POPS ,10% POPG ,60% POPC)以及中性的POPC單一組分。源于LAG3-NCR中W478的芳香環(huán)熒光發(fā)射光譜(AFE)顯示,包含BRS基序的LAG3-NCR和LAG3-FL兩種多肽均與酸性PMLC bicelle互作而與POPC bicelle無互作(圖2A-B)。作為核磁樣品,研究人員合成了僅對關鍵信號域FSALE中的F483和L486進行13C和15N選擇性標記的多肽,測定了多肽在bicelle體系的15N-HSQC發(fā)現。與溶液中的15N-HSQC相比,LAG3-NCR和LAG3-FL兩種多肽的F483和L486在PMLC bicelle中均顯示信號峰化學位移變化和/或峰強減弱,而在POPC bicelle中則幾乎無變化,因而同樣確認了LAG3胞內區(qū)與酸性脂質的特異性互作(圖2C-D)。為了檢測關鍵信號域FSALE在脂質雙層的位置,研究人員測定了帶有過濾掉分子內NOE信號功能的13C-filtered NOESY譜圖(圖2F),旨在檢測多肽與脂質分子之間的分子間NOE信號。圖2E展示了F483的芳香環(huán)側鏈信號,圖2F展示了芳香環(huán)側鏈與脂質分子?;鶜渲g的NOE信號(化學位移1.3 ppm的位置),這些結果表明FSALE包埋在bicelle脂雙層的疏水區(qū)。隨后,研究人員制備了LAG3-NCR與ubiquitin(UB)的融合蛋白,測定了該融合蛋白與LAG3-NCR多肽在PMLC bicelle中的熒光偏振。結果顯示,融合蛋白的熒光偏振值與LAG3-NCR多肽相比明顯減弱,表明LAG3的泛素化妨礙了LAG3的膜結合,將LAG3從膜上釋放了出來,使其處于開放構象,從而對其功能進行調控。綜合上述結果,研究人員提出了由泛素化介導的“埋藏-釋放”動態(tài)調控機制,由此揭示了一種全新的受體活化方式。

圖2.?核磁實驗揭示LAG3胞內信號區(qū)包埋在膜脂雙層內
研究人員依托動物設施,在MC38和B16等小鼠腫瘤模型中,研究證實泛素化缺陷型LAG3顯著削弱腫瘤免疫逃逸能力,凸顯該修飾在LAG3介導的抗腫瘤免疫應答中的核心作用?;谏鲜鰴C制,團隊創(chuàng)新開發(fā)了功能性生物標志物,其檢測值在治療獲益組較非獲益組提升達51.7倍(p=0.0379),顯著優(yōu)于傳統(tǒng)表達水平標志物(僅6.5倍差異且無統(tǒng)計學顯著性,圖3)。這一突破為LAG3靶向治療的精準患者分層提供了全新工具。

圖3.?表征LAG3功能的生物標志物可預測LAG3藥物療效
綜上,該研究不僅揭示了泛素化介導的LAG3動態(tài)調控新機制,還開發(fā)了新型的療效預測生物標志物,為基于LAG3的免疫檢查點阻斷療法提供了新的思路和臨床應用前景。
原文鏈接:https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00199-0